在國共兩黨共同準備北伐的過程中，掌握廣東主要軍事力量的蔣介石另有打算。他把北伐的大規(guī)模軍事行動看作極好的機會，企圖通過北伐擴大自己的地盤和勢力，建立以自己為中心的獨裁統(tǒng)治。

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1926年3月18日，黃埔軍校駐省城廣州辦事處主任歐陽鐘稱“奉蔣校長的命令”，通知海軍局代局長共產(chǎn)黨員李之龍，速派有戰(zhàn)斗力的軍艦聽候調(diào)遣。當李之龍派中山艦到黃埔后，立刻謠言蜂起，說是要劫持蔣介石等等。3月20日，蔣介石在廣州實行緊急戒嚴，逮捕李之龍，監(jiān)視和軟禁大批共產(chǎn)黨人，解除省港大罷工委員會的工人糾察隊武裝，包圍蘇聯(lián)領事館，監(jiān)視蘇聯(lián)顧問。這就是所謂的中山艦事件（又稱三二○事件）。3月22日，國民黨中央政治委員會通過蔣介石提出的在黃埔軍校和第一軍中排除共產(chǎn)黨員、解除蘇聯(lián)顧問季山嘉等人職務、撤回第二師各級黨代表、查辦“不軌”軍官等提案。蔣介石采取突然襲擊的方法，造成緊張局面。然后又玩弄兩面派手法緩和某些矛盾，甚至假惺惺的向以汪精衛(wèi)為首的中央軍事委員會提出“自請從嚴處分”的呈文，聲稱由于事起倉促，“專擅之罪，誠不敢辭”。他還表示此舉與廣州其他各軍無涉。

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中山艦事件發(fā)生后，毛澤東、周恩來等提出應對蔣介石采取強硬態(tài)度，中共廣東區(qū)委負責人也主張回擊蔣介石。但是在廣州的布勃諾夫使團，認為左派力量不足以同蔣介石對抗，反擊會在南方同蔣介石的關系搞得緊張起來，影響蘇聯(lián)對華政策的實施；甚至認為事件的發(fā)生是顧問團的工作，“主要是軍事工作方面所犯的錯誤”所致。鮑羅廷在事件發(fā)生后返回廣州，也主張對蔣介石采取和解政策。在上海的中共中央和陳獨秀最初對中山艦事件的情況不十分了解，沒有立即表態(tài)。布勃諾夫使團到上海介紹了事件的發(fā)生過程，陳獨秀受其影響，看不清事情的本質(zhì)和蔣介石的陰謀，錯誤的認為這是左派內(nèi)部的許多錯誤造成的，不能簡單的用懲辦蔣的辦法來解決，不能讓蔣介石和汪精衛(wèi)之間的關系破裂，更不能讓第二軍、第三軍和蔣介石的第一軍發(fā)生沖突。在妥協(xié)政策的指導下，中共中央接受蔣介石的無理要求，撤回第一軍中的共產(chǎn)黨員。共產(chǎn)黨員被撤除第一軍后，毛澤東、周恩來建議把這些力量派到其他軍去，中共中央也沒有接受他們的主張。

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蔣介石通過中山艦事件，不僅打擊了共產(chǎn)黨，而且打擊了汪精衛(wèi)和國民黨左派，大大加強了他在政治上、軍事上的地位。這一事件成為國共關系發(fā)展中的一個轉折。